El año pasado, los fanáticos de las nuevas tecnologías de edición de genes tuvieron suerte. La Academia Sueca otorgó el Premio Nobel de Química a las investigadoras Jennifer A. Doudna (Universidad de California, Berkeley) y Emmanuelle Charpentier (Instituto Max Planck, Berlín) por el “desarrollo de un método para editar el genoma”. Los equipos de Doudna y Charpentier (y también Virginijus Siksnys) demostraron la aplicabilidad de CRISPR / Cas9 al procesamiento genómico basándose en la investigación básica sobre el “sistema inmunológico” de bacterias y arqueas (incluido el Dr. Francisco Mojica). Y de este artículo en Ciencias Desde esa primera descripción de las tijeras moleculares en 2012, muchos investigadores, grandes y pequeños, han tratado de hacer su parte para mejorar la edición de genes y sus aplicaciones.
Después de mi doctorado, me mudé al Dr. Alberto Ciccia de la Universidad de Columbia para trabajar en la respuesta al daño del ADN y la supresión de tumores. No pensé que me uniría al CRISPR Club, y mucho menos contarles hoy cómo culminó mi viaje con una contribución al campo de la edición genética.
Basta de preámbulos, ¿en qué se basa el estudio?
Este trabajo utiliza una variante de la tecnología CRISPR llamada Editores de bases de datos. Los del laboratorio del Dr. Los editores básicos desarrollados por David Liu en el Broad Institute (Universidad de Harvard) consisten en una fusión de la proteína Cas9 con las enzimas citidina (APOBEC1) o adenosina (tadA) desaminasa. La proteína Cas9 se ha modificado para que no produzca roturas de doble hebra y, por lo tanto, son las enzimas las que introducen mutaciones puntuales dentro de una ventana de actividad dictada por la posición del ARN líder. Basándonos en cómo funciona el sistema CRISPR / Cas9, podemos diseñar una biblioteca de ARN guía que se dirijan a cada posición de NGG para introducir mutaciones en toda la secuencia de codificación de un gen. Al combinar el editor básico con la tecnología de “cribado”, hemos logrado generar mutaciones puntuales en 86 genes que participan en la respuesta al daño del ADN y evaluar su efecto sobre los agentes genotóxicos.
¿Y cómo y para qué se puede utilizar?
Las pantallas con editores básicos nos permiten estudiar la función de las proteínas a mayor resolución que las clásicas pantallas de pérdida de función CRISPR / Cas9. Primero, probamos la robustez del método para analizar el fenotipo de mutación y mostramos que las mutaciones puntuales más dañinas (codones de terminación, mutaciones de corte y empalme) correspondían a fenotipos más severos, mientras que las mutaciones neutrales (silenciosas) no diferían del fenotipo asociado a ausencia. . Mutación.
Ahora estábamos listos para aplicar la técnica a preguntas específicas.
Pérdida, ganancia y separación de mutaciones funcionales.
Los genes que responden al daño del ADN son a menudo esenciales para la viabilidad celular y codifican proteínas multidominio y multifuncionales. Este hecho complica su investigación por los métodos tradicionales de asociación dominio-función, lo que implica que hasta ahora se ha descrito poca ganancia o separación de mutaciones funcionales.
Por ejemplo, la proteína 53BP1 (mi proteína favorita) integra la función de reparar roturas de ADN bicatenario y regular el supresor de tumores p53 a través de su asociación con varias proteínas. Usando el cribado con editores de base aplicados a este gen, descubrimos mutaciones específicas de pérdida y ganancia para su regulación de p53 que no afectan en absoluto su función en la reparación del ADN. Además, estas mutaciones permitieron la definición de una interfaz proteína-proteína nueva, inusual y no canónica en 53BP1.
Interacciones entre mutación y respuesta
Gracias al tratamiento con varios agentes genotóxicos, pudimos utilizar las pantallas del editor básico para identificar mutaciones que causaban sensibilidad o resistencia selectiva.
El caso de TRAIP, una proteína pleiotrópica en respuesta al daño del ADN, fue muy interesante. En este caso, las mutaciones en la región codificada por el exón 7 de TRAIP produjeron sensibilidad a los enlaces cruzados generados por cisplatino pero resistencia a la inhibición de la topoisomerasa I por la camptotecina. Este comportamiento inusual nos permitió definir una nueva región funcional, contraria a la letalidad general observada con mutaciones con pérdida de función en TRAIP. La importancia de esta región es aún mayor si se considera que incluye mutaciones encontradas en pacientes con microencefalia primaria.
Caracterización de mutaciones de relevancia clínica y significado desconocido.
Finalmente, me gustaría destacar la relevancia de esta tecnología a nivel clínico. El uso cada vez mayor de secuenciación masiva y paneles de genes para diagnosticar enfermedades hereditarias y predisposiciones genéticas ha llevado a la identificación de miles de mutaciones de “significado desconocido”. Las pantallas del editor básico tienen el potencial de caracterizar estas mutaciones “in vitro” y determinar si pueden exhibir un comportamiento patógeno. En particular, en nuestro estudio realizamos un análisis comparativo con las mutaciones patogénicas descritas anteriormente y así determinamos el comportamiento patogénico de mutaciones de significado desconocido en CHEK2 y genes que se asocian a una predisposición al cáncer de mama y / o de ovario.
En resumen, el uso de cribados con editores básicos representa un avance en relación con los cribados actuales de pérdida de función que brindan la capacidad de estudiar proteínas a mayor resolución y caracterizar mutaciones clínicamente relevantes a gran escala.
El artículo original se publicó en la revista Cell: Functional Interrogation of DNA Damage Response Variants with Base-Editing Screens (2021). Cuella-Martin y col., Cell 184: 1081-1097. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.041
Para todas las mujeres científicas, este resumen gráfico es para ti:
Dr. El grupo encabezado por John G. Doench ha publicado un artículo paralelo con análisis similares: Evaluación masivamente paralela de variantes humanas con pantallas de editor básicas. (2021) Hanna y col., Cell 184: 1064-1080. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.012
Ambos artículos fueron publicados en un editorial en Nature Review Genetics (https://www.nature.com/articles/s41576-021-00340-0) y en el centro de atención de la revista Molecular Cell (https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1097276521000563?dgcid=author#)
