En los últimos cinco años, prácticamente no ha habido día en que dejamos de levantarnos sin recibir nuevas noticias sobre los avances en el nuevo sistema de edición genética CRISPR / Cas9. Este innovador sistema, cuyo descubrimiento le valió el Premio Príncipe de Asturias, ha permitido desarrollar la edición genética con una precisión y especificidad increíbles. En este post intentaremos explicar el último avance realizado por el Dr. Se desarrolló el laboratorio de Liu (1). Este laboratorio es conocido en el campo de la edición de genes por desarrollar nuevas y extraordinarias herramientas. Estas nuevas herramientas se logran mediante la fusión de enzimas con funciones conocidas con un núcleo central de la enzima Cas9. Para comprenderlo mejor, el investigador y comunicador científico Dr. Lluis Montoliu utiliza un ejemplo muy ilustrativo en el que compara este nuevo Cas9 con una navaja suiza con varias herramientas. Con estas herramientas podemos cortar un trozo de tela para abrir una lata.
Para comprender esta nueva “herramienta”, primero se deben introducir algunos conceptos de biología molecular. El sistema CRISPR / Cas9, que ya se ha explicado aquí, aquí y aquí en este blog, requiere dos componentes además del ADN que se va a modificar:
- La proteína Cas9: una nucleasa que corta el ADN
- Una molécula de ARN o ARN guía (ARNg): esta molécula de ARN se une a Cas9 en un extremo y al ADN en el otro. Esta unión de ADN es muy específica y tiene lugar en una determinada secuencia de ADN (la secuencia de interés) a la que Cas9 debe unirse y cortar el ADN vecino.
La gran revolución del sistema CRISPR / Cas9 es que podemos ubicar una nucleasa llamada Cas9 (que, como se mencionó anteriormente, una nucleasa es una enzima que puede cortar el ADN) en la región deseada del genoma. Allí, la nucleasa corta la región específica del ADN y, dado que esto es importante, la célula tiene que repararlo. ¿Por qué digo forzado? Porque las células normales no pueden vivir cuando tienen cortes en su ADN. Esta “obligación” es tal que la célula incluso cuenta con mecanismos que le impiden sobrevivir o dividirse en caso de rotura del ADN. La necesidad de reparación de la célula es tan grande que la célula tiende a corregir esta zona de corte, incluso si existe el riesgo de que se introduzcan mutaciones (pequeñas deleciones o inserciones) en la zona. El sistema de edición de genes CRISPR / Cas9 utiliza este proceso de reparación después de cortar en una región de ADN específica. Por un lado, podemos introducir mutaciones puntuales en una región específica del ADN para eliminar la expresión de un gen, o incluso podemos proporcionar a la célula “plantillas” de ADN que representan los cambios deseados para corregir las mutaciones puntuales. Pero mira, siempre dependemos del material de la célula, y por qué no decir un poco de coincidencia.
El equipo de Liu logró darle un giro a este sistema de edición genética combinando múltiples enzimas como un cuchillo. Por un lado, utilizan la enzima Cas9 junto con su gRNA; Pero esta enzima tiene una peculiaridad, es un mutante llamado Cas9n (la letra n proviene de Nickase en nick = nick). Esta enzima puede localizarse en la región del ADN indicada por el ARNg, pero no puede cortar el ADN de doble hebra. En analogía con un par de tijeras, este mutante ha hecho una muesca en uno de los bordes de las tijeras (mutaciones en su centro activo) de modo que este Cas9n está en la región deseada del ADN, pero solo puede cortar una hebra. Entonces Liu y su equipo decidieron vincular el sitio activo de otra enzima para editar el genoma.
El equipo de David Liu fusionó primero un fragmento de una enzima con un Cas9 inactivo, lo que le dio una actividad llamada desaminasa, que podría convertir letras de ADN en otras. En particular, Liu y su equipo utilizaron una enzima que podría convertir C en T (2). Esta primera “herramienta” o variante CRISPR fue desarrollada en 2016 y fue conocida como “Editores de Base”, con la que se pueden cambiar con precisión ciertas bases del genoma. Sin embargo, su potencial se vio seriamente comprometido cuando se descubrió que causaban numerosos cambios genéticos indeseables. Después de este primer intento, Liu y su equipo decidieron fusionar una enzima llamada transcriptasa inversa (RT) con la Cas9 inactiva. Hagamos una pausa aquí por un momento para comprenderlo bien.
¿Qué es la enzima RT?
RT es una enzima que puede sintetizar ADN utilizando ARN como plantilla. Sí, todo lo contrario de lo que indica el dogma central de la biología molecular. Este dogma indica que el ADN se transcribe en ARN y el ARN se traduce en proteínas (ver Figura 1).
Figura 1: Dogma central de la biología molecular, en el que se establece claramente cómo es el flujo de información genética ADN> ARN> proteínas. Describe en detalle cómo la transcriptasa inversa (RT) puede revertir este flujo.
Si funciona al revés de lo habitual, ¿para qué sirve esta enzima?
Esta enzima es utilizada por muchos virus (incluido el SIDA) del grupo de los retrovirus para sintetizar su material genético después de que las células han sido infectadas. Estos retrovirus llevan ARN como material genético, y lo primero que hacen después de infectar una célula es sintetizar ADN a partir de ese ARN. Y una vez que sintetizan el ADN viral, comienzan a usarlo normalmente.
¿Cuál fue la idea genial o “feliz”?
El equipo de Liu decidió fusionar estas dos enzimas. Es una idea revolucionaria y muy exitosa porque ahora tenemos una enzima que usa ARN para posicionarse en una región del genoma y también puede usar ese ARN para sintetizar nuevo ADN. Dicho esto, estamos convirtiendo la necesidad en una virtud, ya que el ARN ahora sirve no solo como una guía para Cas9, sino también como una plantilla para hacer ADN con los cambios genéticos que queremos introducir. La diferencia es que ahora necesitamos un ARN un poco más largo. Solo para señalar que, si bien la fusión de enzimas suena a ciencia ficción, es un mecanismo muy común en la ingeniería genética. Una enzima no es más que una cadena de aminoácidos. La información sobre la correcta colocación de los aminoácidos se encuentra en el ARN, que a su vez proviene de una cadena de ADN. Entonces, si empalmamos una cadena de ADN que codifica la Enzima A y la colocamos junto a la cadena de ADN que codifica la Enzima B, podemos producir una enzima AB que trabaja con las propiedades de A y B.
pero como funciona?
Esta es la gran y brillante innovación. Decidieron alargar la molécula pequeña de ARNg de plomo (generalmente alrededor de 18 a 20 bases) que se usa para colocar Cas9n en una región específica del genoma. Esta nueva molécula mucho más larga ahora tiene dos extremos diferentes, lo que permite que la misma molécula de ARN se use para dos cosas:
- Un extremo sirve como ARNg, lo que significa que identifica la secuencia de ADN específica necesaria para colocar Cas9 en la ubicación deseada en el genoma.
- El otro extremo sirve como plantilla para el RT. Esta RT, como hemos indicado, sintetiza una nueva cadena de ADN que sustituye a la que cortamos. Esta síntesis la realiza RT a partir de la secuencia que colocamos en este nuevo extremo del ARN para que podamos insertar pequeñas variaciones.
Esto permitirá que se incluyan las letras correctas para corregir una mutación. O generarlo al revés cuando se trata de saber qué sucede cuando ese gen está mutado.
Imagen obtenida de Addgene (https://blog.addgene.org/prime-editing-crisp-cas-reverse-transcriptase)
¿Qué hay de nuevo en este sistema?
Una edición de calidad. Gracias a esta nueva herramienta CRISPR modificada, se logró una nueva forma de edición de genes, basada en la creación de una proteína Cas9-RT fusionada que no existía previamente en la naturaleza. Llamaron a esta capacidad desconocida “Prime Editing” (PE), que en inglés juega con el doble significado de “Quality Editing” y “Guided by a Mold”.
Según el equipo de Liu, esta nueva herramienta teóricamente podría corregir alrededor del 90% de los más de 75.000 errores genéticos que causan enfermedades en los humanos. Y es posible que se pregunte por qué este número. Bueno, porque esta herramienta está diseñada para realizar cambios pequeños o específicos que constituyen el 89% de los cambios conocidos. Tenga en cuenta que la capacidad de procesamiento está limitada por la longitud del ARN de la plantilla guía en sí y no debe ser “kilómetros”.
Gracias al trabajo de Liu, ahora sabemos que la PE funciona en células humanas cultivadas, aunque no en todos los tipos de células. Es importante que los cambios previstos 1) se logren con buena eficiencia y, sobre todo, 2) se reduzca en gran medida la variabilidad de los resultados y la generación de mutaciones no deseadas en otras partes del genoma.
Pero todavía no sabemos si funcionará en animales y humanos ni cómo funcionará. Ahora tenemos que esperar con cautela a que otros laboratorios confirmen y reproduzcan los resultados para que podamos aplicarlos a los pacientes más adelante. Al mismo tiempo, felicito a los autores de esta fantástica idea.
Hinchar:
Este artículo se ha actualizado con información del artículo “El CRISPR más preciso hasta la fecha transforma las tijeras genéticas en navajas suizas. “
