CRISPR es la abreviatura de “Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas”, que se puede traducir como algo así como “Repeticiones cortas palindrómicas regulares interespaciadas y agrupadas” (en la misma región del genoma). Junto con CRISPR aparecen las “Proteínas Asociadas a CRISPR (Cas)”, que son las proteínas que se asocian a este sistema para hacerlo funcional.
Representación esquemática de la ubicación de los sistemas CRISPR-Cas de tipo I y tipo II. En rojo el gen que da identidad a cada sistema: Cas3 para el tipo I y Cas9 para el tipo II. En azul y verde los genes universales Cas1 y Cas2. Los diamantes negros representan las secuencias repetidas o “repeticiones” y los cuadrados representan las secuencias espaciadoras o “espaciadores”, cada color representa un diferente.
Los sistemas CRISPR representan el sistema inmunológico de las bacterias que reconoce específicamente el material genético de los virus que intentan infectarlos. atacarlo cortando su ADN y destruyéndolo. Sin embargo, lo que hizo famoso a CRISPR es su uso como herramienta de edición genómica, generalmente basada en la nucleasa Cas9.
La tecnología basada en CRISPR ha tenido un gran impacto en el campo científico en los últimos 10 años, pero ha sido particularmente revolucionaria en los últimos 5 años ya que está mejorando debido a su infinita aplicación para la manipulación genómica en todo tipo de organismos y áreas de estudio desde fermentos lácticos para uso industrial para su aplicación en salud humana. La base de esta tecnología radica en la capacidad de reprogramar los sistemas CRISPR y de controlar la nucleasa (enzima que corta el ADN) para que actúe específicamente en la región de ADN (o ARN) deseada. Esta capacidad de reprogramar el sistema junto con su increíble especificidad lo ha convertido en una revolución en la edición genómica y uno de los mayores descubrimientos científicos de los últimos años.
En su forma nativa, CRISPR funciona como un sistema inmunológico para las bacterias, por lo que la secuencia espaciadora o el “espaciador”, que consta de 20 a 30 nucleótidos, le dice a la nucleasa a qué región del ADN penetrante debe unirse y luego cortar. Esta secuencia espaciadora está ligada a una secuencia repetida o “repetición” que, junto con otros componentes, son los que interactúan físicamente con la nucleasa para dirigirla. Estos componentes dependen del tipo de CRISPR. De estos, actualmente se describen 2 clases y 6 subtiposSin embargo, el Tipo I y el Tipo II son los mejor estudiados hasta ahora.
Esquema del funcionamiento de los sistemas CRISPR-Cas Tipo I y Tipo II a medida que interactúan con el ADN objetivo para cortarlo.
El sistema CRISPR Tipo II, cuya identidad es la endonucleasa Cas9, es el más estudiado y utilizado universalmente, así como el más simple, en el que un par de componentes representa el ARN guía o “ARN guía” que controla la nucleasa. La capacidad de reprogramar este ARN guía se basa en dejar intacta toda su estructura y modificar solo los 20 a 30 nucleótidos que componen la secuencia espaciadora, modificando así la nucleasa diana diana. La capacidad de reprogramar el sistema CRISPR fue desarrollado por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier y es lo que ha dado lugar a todo un abanico de opciones para posibles usos en la edición de genes, desde bacterias a humanos pasando por todo tipo de organismos y en todas las aplicaciones imaginables.
La especificidad de CRISPR radica en la homología perfecta que debe existir entre los 20-30 nucleótidos que componen la secuencia espaciadora y el ADN diana para marcar la diferencia. en un solo nucleótido el sistema no funcionará (Ref. 4). Como si esto no fuera suficiente, una vez que se ha encontrado la homología con la secuencia diana, también debe haber una secuencia de 3-4 nucleótidos en el ADN diana llamada “Motivo adyacente protospaciador” (PAM) y se reconoce que se une a la nucleasa específica. y producir el corte en el ADN.
Las posibles aplicaciones de la técnica son casi ilimitadas, pero aquí no vamos a hablar de edición genómica, que sin duda es una de las más importantes, sino que nos centraremos en la posibilidad de utilizar CRISPR como nuevo agente antimicrobiano. Esta aplicación permite el uso de la tecnología CRISPR para la erradicación específica de patógenos humanos o animales. Es decir, CRISPR se reprograma para que la nucleasa ataque específicamente al ADN de un patógeno (virus o bacteria), lo corta y provoca un daño irreparable que impide que el patógeno sobreviva. El daño al ADN es fatal, por lo que los mecanismos de reparación del ADN del patógeno no son lo suficientemente efectivos para repararlo y, por lo tanto, muere. Además, se puede incluir más de una secuencia espaciadora en el sistema, de modo que el sistema CRISPR conduce la nucleasa a diferentes puntos del ADN patógeno y crea tantos cortes como secuencias espaciadoras hay, lo que aumenta aún más la letalidad y las posibilidades de éxito.
La especificidad de estos sistemas, basada en la perfecta homología de la secuencia espaciadora junto con la secuencia PAM (explicada anteriormente), les permite actuar sobre el patógeno con total especificidad sin dañar a todas las bacterias comensales que forman parte de nuestro organismo. Esto ocurre actualmente con los antibióticos que matan indiscriminadamente sin distinguir entre bacterias “buenas” y “malas”. Por lo tanto, podemos estar seguros de que el sistema CRISPR no alterará el resto de las poblaciones bacterianas de nuestro cuerpo, y mucho menos dañará una célula humana. Otra posible estrategia es reprogramar CRISPR para apuntar al gen de resistencia a los antibióticos, que a veces está codificado en plásmidos en lugar del cromosoma del patógeno. De esta forma, una vez destruido el gen de resistencia a los antibióticos, el patógeno vuelve a ser susceptible a los antibióticos actuales y también se evita la propagación del gen de resistencia a otras bacterias.
Si bien todas las aplicaciones en la edición genómica se han basado en la endonucleasa Cas9, los usos de CRISPR como agentes antimicrobianos parecen basarse en el uso de exonucleasa Cas9 y Cas3. La endonucleasa Cas9 crea un corte en la doble hebra de ADN en un solo punto que puede repararse y usarse para corregir mutaciones, crear inserciones o deleciones, etc. Sin embargo, la nucleasa Cas3, a pesar de que corta solo una de las hebras de ADN, tiene actividad exonucleasa, por lo que el corte continúa degradando el ADN como si fuera un “comecoccus”, produciendo un daño fatal irreparable.
Actualmente, varios grupos de investigación de todo el mundo están investigando el uso de CRISPR como un nuevo antimicrobiano. Esto ha dado lugar a numerosas patentes y la creación de varias “empresas emergentes” de universidades y centros de investigación con el objetivo de desarrollar esta tecnología para su uso en humanos.
Sin embargo, todavía existen ciertas limitaciones para el uso de esta tecnología. Las nucleasas son proteínas que actúan dentro de la célula atacando el ADN. Por lo tanto, para poder atacar el ADN de un patógeno, debemos poder llevar el sistema CRISPR al patógeno, es decir, a la bacteria o al virus, para cortar su genoma. La limitación actual es encontrar mecanismos eficientes para administrar el sistema CRISPR y llegar eficazmente a los patógenos. Numerosos estudios han demostrado la capacidad de destruir patógenos en condiciones de laboratorio in vitro mediante la introducción del sistema CRISPR en las bacterias patógenas a través de procedimientos estándar en tubos de ensayo. Sin embargo, esto no se puede aplicar a un paciente por razones obvias. Además, el patógeno se puede distribuir en diferentes partes del cuerpo humano o en áreas que no son accesibles para la aplicación directa del sistema CRISPR. Algunos estudios en animales han demostrado que CRISPR es eficaz contra las infecciones de la piel. y hay quienes sugieren administrar CRISPR en grandes cantidades utilizando una solución o incluso una pomada. Sin embargo, el principal objetivo de la mayoría de los estudios actuales es poder erradicar patógenos intestinales del microbioma humano como el Clostridium difficile, que causa infecciones graves recurrentes con una alta tasa de mortalidad y se ha convertido en una bacteria. resistente a todo tipo de antibióticos. Otros estudios actuales se dirigen a los patógenos intestinales que pertenecen a los grupos Shigella o Salmonella. En todos estos casos, es aún más difícil entregar eficazmente el sistema CRISPR al patógeno, ya que una vez administrado tiene que sobrevivir al paso del estómago, llegar a los intestinos y acceder allí al interior del patógeno. Las estrategias actuales se basan en el uso de fagos, que son precisamente virus que pueden infectar bacterias. De esta manera podemos utilizar un virus bacteriano (un fago) como vector del sistema CRISPR para que al administrar el virus (inofensivo para los humanos) llegue al intestino, reconozca específicamente las bacterias patógenas y el sistema CRISPR lo inyecte.
Uso de fagos para administrar sistemas CRISPR-Cas. A) El fago se une específicamente a la bacteria patógena y luego de la inyección de su material genético (previamente modificado) el sistema CRISPR-Cas puede reconocer y atacar el ADN diana, el cromosoma del patógeno, resultando en su muerte. B) El fago se une específicamente a las bacterias patógenas y luego de la inyección de su material genético (previamente modificado) el sistema CRISPR-Cas puede reconocer y destruir el ADN diana, el gen de resistencia a antibióticos codificado en un plásmido, de manera que las bacterias patógenas son siguen vivos, pero son sensibles al antibiótico.
Toda una obra de ingeniería genética que erradicaría específicamente el patógeno sin cambiar el resto de bacterias comensales de la microbiota intestinal. Si bien los resultados preliminares son alentadores, queda mucho por hacer, primero realizando ingeniería genética en fagos capaces de expresar el sistema CRISPR, y luego examinando las vías de administración para que los fagos lleguen a la población diana de manera viable, el patógeno que está una eficacia clínicamente relevante permite. El uso de fagos aumenta la especificidad del sistema, ya que los fagos tienen un rango de huéspedes muy específico. Esto asegura que el fago no infecte las bacterias equivocadas, pero al mismo tiempo es una limitación para desarrollar una herramienta eficaz contra varios patógenos. Actualmente existen otras propuestas que podrían utilizarse como vectores para los sistemas CRISPR. Se encuentran en las primeras etapas de la investigación, pero sin duda producirán grandes resultados en los próximos años.
Como punto final, será interesante ver cómo reaccionan los reguladores ante la aplicación de esta tecnología como un nuevo antimicrobiano, ya que se basa en la ingeniería genética, y a pesar de la seguridad de su uso, es muy probable que atraiga críticas por parte de los reguladores. y, por supuesto, plataformas anti-GVO. Esperemos que prevalezca el sentido común y que se establezca un marco legal acorde con los avances científicos y el desarrollo de la tecnología, y lo más importante la necesidad de desarrollar nuevos agentes antimicrobianos que nos permitan superar las adversidades existentes con los antibióticos actuales. .
