A estas alturas, casi todos los interesados en la ciencia han oído hablar de la tecnología CRISPR. Esta herramienta genética surgió como tal en 2012 y desde entonces se ha consolidado como una de las grandes promesas de la biología molecular. Hay novedades al respecto todos los años.
Bueno, en 2020 damos un paso más. De nuevo fueron investigadores Instituto amplio los que han publicado en naturaleza este nuevo avance. Veamos de qué está hecha la novedad.
¿QUÉ NUEVOS PRODUCTOS PIENSASTE?
Los investigadores han desarrollado una herramienta que puede detectar cientos de virus diferentes en una cantidad determinada de muestras clínicas al mismo tiempo. Sin embargo, este método también permite la detección de un solo virus en más de mil muestras clínicas. El método se llamó CARMEN, una abreviatura de Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic Acids.
¿CÓMO LO HICISTE?
Para lograrlo, combinaron dos herramientas. Por un lado, SHERLOCK, del que ya hablamos en este post en 2018, y por otro lado el Dispositivos de microfluidos.
Nos gustaría recordarle brevemente que SHERLOCK, abreviatura de Desbloqueo de reportero enzimático de alta sensibilidad específico, es una herramienta derivada de CRISPR que se utiliza como técnica de diagnóstico. Si recuerdas cuando explicamos por primera vez la tecnología CRISPR, explicamos que los sistemas CRISPR usan proteínas llamadas Cas que cortan el ADN en áreas específicas y específicas. Para llegar a estas áreas y ubicarse en esa parte particular del ADN, Cas es dirigido por una pequeña molécula de ARN que es complementaria al área de ADN donde trabaja la proteína Cas. Al principio, Cas 9 se usó como proteína Cas, pero luego se usaron otras proteínas de la misma familia. Hay proteínas Cas como Cas13a que pueden cortar Moléculas de ARNen lugar de ADN. Los investigadores del Broad Institute encontraron que esta casa tenía un problema “menor”. Una vez que encontró la secuencia específica de ARN que necesitaba cortar, cortó no solo esa secuencia específica, sino que cortó aleatoriamente cada ARN. Es decir, corte la secuencia específica y primero entonces el resto del ARN. Obviamente, esto lo invalidaba para la edición de genes. Los mismos investigadores convirtieron una debilidad en una oportunidad. A partir de este “error” o efecto indeseable, desarrollaron una poderosa herramienta de diagnóstico.
Imaginemos una muestra clínica que puede contener un virus. Extraemos el ARN de esta muestra y lo mezclamos con otras pequeñas moléculas de ARN a las que hemos añadido compuestos fluorescentes, pero que solo emiten luz cuando se separan del ARN, es decir, cuando se corta. Luego agregamos el sistema CRISPR Cas13a. Es decir, configuramos el CAS13a guiados por un ARN que lo hace buscar y cortar una determinada secuencia del virus que queremos detectar. Si este ARN no está allí, Cas13a no lo encontrará y no cortará nada. Recuerdalo Solo corte el ARN al azar una vez que corte la secuencia específica primero. Si no corta, no hay fluorescencia, no hay luz. Por tanto, la muestra es negativa. Por el contrario, cuando encuentra la secuencia y la corta, empieza a cortar los ARN ligados a las moléculas fluorescentes que añadimos, y así se detecta la luz: la muestra es positiva.
los Dispositivos de microfluidos Son los que utilizan cantidades muy pequeñas de líquido en un microprocesador. Estos dispositivos ya se utilizan como mecanismos de diagnóstico, ya que al utilizar nanogotas, las cantidades requeridas tanto de muestras como de reactivos son muy pequeñas. En este caso, los investigadores del Broad Institute utilizaron un dispositivo desarrollado originalmente en 2018 desde el laboratorio de Paul Blainey por el descubrimiento de nuevos fármacos.
Imagen del dispositivo microfluídico original. Tomada por https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6042083/
Como se puede ver en la imagen, es un chip de silicio que tiene decenas de miles de pozos hechos en él, pequeños orificios en los que solo pueden caber dos nanogotas, y que se verían como los tubos de ensayo en los que está ejecutando la reacción.
¿COMO FUNCIONA?
Primero, se crean dos nanogotas:
El siguiente paso es mezclar una nano-gotita de cada tipo y colocarla en los pozos discutidos anteriormente. Luego, las muestras se conectan mediante una descarga eléctrica que simultáneamente desencadena la reacción en las decenas de miles de pozos del chip. Luego ocurre la fluorescencia (si corresponde), que es detectada por un microscopio de fluorescencia e interpretada por una computadora.
Debemos ser conscientes de que podemos analizar más de mil muestras contra un virus o hasta 169 virus diferentes en un número menor de muestras (cinco). Esto significa que si hemos hablado antes de nanogotas, a dónde van los reactivos, no nos estamos refiriendo a una única solución a partir de la cual se hacen las nanogotas, sino que existen tantos tipos de nanogotas de reactivos como queramos reconocer (hasta 169 tipos diferentes), cada uno con un código de color fluorescente diferente. Lo mismo se aplica a las muestras.
Cada prueba contiene sus réplicas y controles para garantizar la solidez estadística y garantizar que los resultados sean fiables.
Imagen del artículo original (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8)
¿PARA QUÉ SIRVE?
Bueno, CARMEN-Cas-13 se puede utilizar de dos formas:
Las aplicaciones en detección son numerosas. Por ejemplo, se diseñó un panel para detectar docenas de mutaciones en el VIH que lo hacen resistente a los medicamentos. Esto, por supuesto, es de gran ayuda para determinar el tratamiento más adecuado para cada paciente.
Todo esto se hace en un solo dispositivo solo un poco más grande que un teléfono inteligente. Todo el protocolo, incluida la extracción de ARN, tomó poco menos de ocho horas, aunque ya se está trabajando para reducir este tiempo. Además, esta nueva tecnología reduce significativamente el costo de cada prueba, como puedes ver en la tabla. Desde usar Sherlock en un plato regular a un costo de $ 5.52 por prueba a $ 0.05-0.42 por muestra en el dispositivo de microfluidos.
Imagen del artículo original (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8)
En definitiva, estamos ante un avance importante que tiene más que ver con CRISPR y es útil para el diagnóstico en este caso.
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